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如何實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥殘留ELISA檢測(cè)試劑盒產(chǎn)業(yè)化
更新時(shí)間:2013-08-15   點(diǎn)擊次數(shù):1708次

 為了使農(nóng)藥殘留ELISA檢測(cè)試劑盒能夠被更多人了解,很好的應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化中,本公司集所有的研究人員進(jìn)行了這次大規(guī)模的研究,現(xiàn)將研究報(bào)告如下:
 本研究以農(nóng)藥三唑磷及克百威為研究對(duì)象,采用分子模擬方法對(duì)其半抗原分子進(jìn)行了設(shè)計(jì)并合成得到了兩種優(yōu)化的三唑磷半抗原兩種半抗原O-乙基,O-[1-苯基-(H-1,2,4-三唑-3-基),N-(3-羧基-丙基)]硫代磷酸胺(THBu)、O-乙基,O-[1-苯基-(H-1,2,4-三唑-3-基),N-(5-羧基-丙基)]硫代磷酸胺(THHe)和一種克百威半抗原4—[[(2,3-二氫-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]丁酸(BFNB)。上述半抗原分別與載體蛋白偶聯(lián)制備成人工抗原,免疫小白鼠,再采用雜交瘤技術(shù)制備出了對(duì)應(yīng)單克隆抗體。經(jīng)測(cè)定,抗體(腹水)的效價(jià)均在10~6以上,與對(duì)應(yīng)農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均較低,表現(xiàn)出很高的特異性。在此基礎(chǔ)上,通過對(duì)固相載體、包被緩沖液、有機(jī)溶劑、包被條件、洗滌次數(shù)、酶的種類、封閉物種類、點(diǎn)板時(shí)間、工作濃度、穩(wěn)定劑以及不同ELISA模式等因素的篩選比較,優(yōu)化了三唑磷和克百威ELISA檢測(cè)試劑盒方法和條件。
 優(yōu)化后結(jié)果顯示:
1、Costar酶標(biāo)板(美國(guó))吸附效果和均一性較好;
2、抗體以PBS(pH 7.4,0.01M)作為包被介質(zhì)較為理想,人工抗原則以CBS(pH 9.5,0.05M)作為包被介質(zhì)較為理想;
3、包被條件以在37℃下包被2h效果為佳;
4、反應(yīng)介質(zhì)加入2%牛奶可減少非特異性吸附,提高檢測(cè)靈敏度;
5、有機(jī)溶劑中甲醇對(duì)ELISA反應(yīng)的影響較小,反應(yīng)體系中zui終含量10%為佳;
6、HRP酶作為顯色反應(yīng)的催化劑比AP酶更為理想;
7、包被抗原直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA模式OD值的平行性不如包被抗體直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA模式的好;
在以上條件下優(yōu)化出的穩(wěn)定劑可使包被在酶標(biāo)板上的抗體在37±1℃條件下保存14天而抗體活性基本保持不變。
 利用優(yōu)化后的分析條件,建立了農(nóng)藥三唑磷異源直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法(包被抗體模式)和克百威直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法(包被二抗模式)。在考察了不同樣品基質(zhì)對(duì)ELISA方法的影響后,進(jìn)一步對(duì)蔬菜樣品、水果樣品、水、土等環(huán)境樣品進(jìn)行了三唑磷和克百威添加回收率試驗(yàn),檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,考察了方法的準(zhǔn)確度與精密度,并對(duì)不同處理組間、相同處理組板間的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn),確定了不同樣品的方法本底值、zui低檢測(cè)限及檢測(cè)結(jié)果陰性/陽(yáng)性判定方法,zui終構(gòu)建了三唑磷ELISA快速測(cè)定試劑盒和克百威ELISA檢測(cè)試劑盒。

 

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